顆粒在線訊：三維(3D)生物打印為制造復(fù)雜的載有細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)提供了一條新路徑。然而，由于大多數(shù)生物打印過程的內(nèi)在復(fù)雜性，以及缺乏長(zhǎng)期儲(chǔ)存載有細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)的功能性方法，現(xiàn)有的生物打印的一個(gè)重大缺點(diǎn)是打印的細(xì)胞組織只能立刻使用難以保存。結(jié)合制造和儲(chǔ)存方法（即生物打印和冷凍保存）是解決上述障礙的潛在解決方案。而這種方法應(yīng)該解決的主要挑戰(zhàn)是冰晶的形成和重結(jié)晶，這可能會(huì)對(duì)制造的產(chǎn)品中的細(xì)胞活力產(chǎn)生負(fù)面影響。冷凍保護(hù)劑(CPA)被認(rèn)為對(duì)消除或最小化冰晶形成具有關(guān)鍵作用。二甲基亞砜(DMSO)是一種傳統(tǒng)的CPA，具有較大分子量的CPA（如糖類）可以保護(hù)細(xì)胞免受凍融期間細(xì)胞外高滲和低滲條件引起的滲透損傷。

哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Yu Shrike Zhang教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種低溫生物打印策略，通過無縫結(jié)合擠壓生物打印和低溫保存，可以同時(shí)制造和存儲(chǔ)充滿細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)。在冷凍板精確控制溫度條件下，使用不同類型和濃度的CPA設(shè)計(jì)了基于甲基丙烯酸酐化明膠(GelMA)的生物墨水組合物，并使用擠壓式生物打印機(jī)制造出充滿細(xì)胞的不同形狀的組織結(jié)構(gòu)。原位冷凍過程進(jìn)一步提高了細(xì)胞負(fù)載水凝膠生物墨水的打印性能，并且能夠制造各種所需形狀的結(jié)構(gòu)。細(xì)胞分化和血管生成數(shù)據(jù)顯示，冷凍生物打印的細(xì)胞在復(fù)蘇后仍然具有活力和功能。該策略可廣泛用于組織工程、再生醫(yī)學(xué)、組織模型工程和藥物篩選的應(yīng)用，為臨床前和臨床環(huán)境中的組織替換等研究鋪平道路。此研究以題為“Freeform cell-laden cryobioprinting for shelf-ready tissue fabrication and storage”發(fā)表在最新一期的《Matter》上。

圖1：用于同時(shí)低溫保存的生物打印示意圖

【冷凍打印和傳熱模擬】

該方法的關(guān)鍵點(diǎn)是載有細(xì)胞的水凝膠前體在一個(gè)定制的可精確控制溫度的冷凍板上進(jìn)行生物打印組織構(gòu)建。從生物打印機(jī)噴嘴擠出并與冷凍板接觸后，生物墨水原位迅速凝固并形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，以便短期和長(zhǎng)期儲(chǔ)存。低溫保存條件下取出后，首先紫外交聯(lián)，然后在預(yù)加熱37℃的PBS中快速解凍，避免冰晶形成的同時(shí)去除殘留的CPA。使用5% (w/v)的GelMA或明膠作為基礎(chǔ)生物墨水來創(chuàng)建自由形狀的結(jié)構(gòu)，其中一些結(jié)構(gòu)可以通過傳統(tǒng)的直接擠壓生物打印方法進(jìn)行復(fù)雜化。在COMSOL軟件中對(duì)網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的逐層低溫生物打印進(jìn)行建模，以了解該過程中的熱傳遞機(jī)制。冷凍生物墨水的邊界與模擬模型的邊界完美匹配，表明模擬與實(shí)驗(yàn)之間具有良好的一致性。

圖2：樣品低溫生物打印構(gòu)建和模擬結(jié)果

【基于細(xì)胞活力測(cè)定的低溫保護(hù)生物墨水設(shè)計(jì)】

研究了生物墨水成分（GelMA、DMSO和列出的六種糖類之一）對(duì)各種細(xì)胞的冷凍保存和復(fù)蘇的影響。在不含DMSO的對(duì)照樣品中，高度針狀的冰晶快速形成。增加DMSO濃度，冰晶的平均尺寸顯著減小。當(dāng)糖濃度增加時(shí)，沒有觀察到結(jié)晶的顯著改善，但無論DMSO濃度如何，無糖組的細(xì)胞存活率普遍較低。糖的存在避免了解凍過程中的滲透休克，是低溫保護(hù)生物墨水的重要組成部分。將各組細(xì)胞活力按相同DMSO濃度歸一化至對(duì)照組，選擇功能最豐富的糖及其最適濃度。結(jié)果顯示提高細(xì)胞存活率的最有效糖類為12% (w/v)的肉豆蔻糖、4% (w/v)的棉子糖和4% (w/v)的乳糖，DMSO的濃度為10% (v/v)。使用三個(gè)選擇的生物墨水組合來評(píng)估方法的可行性，結(jié)果顯示冷凍保存72h后，所有細(xì)胞類型的存活率均明顯高于未添加CPA的對(duì)照組。

表1：所用的糖類及其性質(zhì)

圖3：不同墨水低溫保存后的細(xì)胞活力

【冷凍生物打印對(duì)細(xì)胞影響】

冷凍生物打印過程中的樣品冷凍率對(duì)冰晶形成和細(xì)胞活力具有重要影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明細(xì)胞活力不受與冷凍板距離的顯著影響，支架不同層內(nèi)的平均細(xì)胞活力均在85%左右，在可接受的范圍內(nèi)。冷凍生物打印的載有人類間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）的樣品冷凍保存14天和28天后，未觀察到液氮中冷凍保存的樣品的細(xì)胞存活率之間存在顯著差異。

使用hMSCs通過冷凍生物打印后的細(xì)胞分化測(cè)定來研究它們的功能。冷凍生物打印的載有hMSCs的樣品在液氮中冷凍保存14天后，將樣品交聯(lián)、復(fù)蘇并培養(yǎng)1周，然后再加入分化培養(yǎng)基。研究了成骨、成軟骨和成脂三種類型的細(xì)胞分化，結(jié)果顯示冷凍生物打印樣品不會(huì)對(duì)hMSC的功能產(chǎn)生負(fù)面影響。

絨毛膜（CAM）測(cè)定用于評(píng)估冷凍生物打印支架的血管生成潛力。同樣地，液氮中冷凍保存14天后，構(gòu)建的打印物被植入到第7天的卵泡CAM中，并在7天的孵育后被收集。使用圖像處理方法和組織學(xué)確定冷凍生物打印組織中血管生成的程度，測(cè)量新形成的血管的平均長(zhǎng)度以量化圍繞不同冷凍生物打印結(jié)構(gòu)的血管生成反應(yīng)。結(jié)果顯示，冷凍生物打印程序不會(huì)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的功能。

圖4：低溫生物打印的細(xì)胞活力和細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)

【小結(jié)】

綜上所述，該工作報(bào)告并優(yōu)化了一種冷凍生物打印方法，可同時(shí)制備和存儲(chǔ)載有細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)。載有細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)可以長(zhǎng)期儲(chǔ)存并在交聯(lián)、解凍和復(fù)蘇后使用，不會(huì)影響其正常功能。隨著組織工程領(lǐng)域的快速發(fā)展，這些可存儲(chǔ)的植入物有望促進(jìn)生物打印方法的臨床轉(zhuǎn)化。