顆粒在線訊：炎癥性腸病(IBD)包括克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)，是一種復(fù)雜的、多因素的免疫介導(dǎo)的疾病。全球約有690萬IBD病例，并且這一數(shù)字還在增加。2020年，美國約有250萬IBD病例，預(yù)計(jì)到2030年，這一數(shù)字將增加到350萬。每年有33,000個(gè)新病例被診斷。大約30% - 40%的CD患者會(huì)發(fā)生肛周瘺(PAF)。CD-PAF估計(jì)每年影響15,000多名新患者。CD-PAF可伴有肛周疼痛、膿性或污性引流、明顯的大便失禁和疊加感染。CD-PAF的這些并發(fā)癥與生活質(zhì)量下降和發(fā)病率相關(guān)。目前的臨床治療策略旨在促進(jìn)瘺管的長期愈合，同時(shí)避免尿失禁和轉(zhuǎn)流造口。然而，這些方法的成功率不到50%。例如，隨機(jī)臨床試驗(yàn)表明，英夫利西單抗(一種腫瘤壞死因子-α (TNF-α)抗體，是治療管腔炎癥最有效的方法之一)僅誘導(dǎo)23%的CD-PAF完全閉合。其他藥物治療，包括抗生素或免疫調(diào)節(jié)劑，在CD-PAF的長期治療中效果更差，多達(dá)70%的瘺管在停止治療后復(fù)發(fā)(15-17)。另一種治療CD-PAF的方法是手術(shù)。不幸的是，解決CD患者PAF的手術(shù)干預(yù)措施受到以下因素的影響：瘺管頻繁復(fù)發(fā)，以及可導(dǎo)致大便失禁的局部并發(fā)癥(如肛門括約肌損傷)。

基于此，美國約翰霍普金斯大學(xué)Florin M. Selaru教授和毛海泉教授合作發(fā)現(xiàn)了一種可注射、生物可降解、機(jī)械可破碎的納米纖維-水凝膠復(fù)合材料(mfNHC)負(fù)載脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)，用于治療CD-PAF大鼠模型的瘺管。與外科手術(shù)治療相比，負(fù)載ADSCs的mfNHC治療瘺管的愈合程度更高，是一種標(biāo)準(zhǔn)治療方法。與外科治療相比，mfNHC治療的瘺管體積減少了6倍。分子研究表明，mfNHC的使用減少了局部炎癥并改善了組織再生。本研究表明負(fù)載ADACs的mfNHC是一種有前景的CD-PAF治療方法，值得進(jìn)一步研究將mfNHC推向臨床轉(zhuǎn)化。相關(guān)工作以“A nanofiber-hydrogel composite improves tissue repair in a rat model of Crohn’s disease perianal fistulas”發(fā)表在《Science Advances》。

圖1. ADSC-mfNHC的合成與表征

剛性和孔徑可調(diào)的mfNHC的制備

mfNHC是通過將PCL纖維碎片與HA水凝膠結(jié)合來合成的。為了便于給藥，研究者開發(fā)了一種可以注射到瘺管內(nèi)的NHC復(fù)合材料。研究者設(shè)計(jì)并合成了幾個(gè)剛度水平的mfNHC，以確定最優(yōu)的材料剛度，允許注射到瘺管中，以及宿主細(xì)胞浸潤到復(fù)合材料中。首先，研究者調(diào)整了復(fù)合材料的孔徑大小，因?yàn)檫@一力學(xué)特征直接影響宿主再生細(xì)胞遷移到復(fù)合材料中的能力。首先，HA與丙烯酸縮水甘油酯反應(yīng)，將丙烯酸酯基團(tuán)與HA結(jié)合，生成NHC前體，丙烯酸酯修飾的HA (HA- ac)。接下來，如前所述制備靜電紡PCL納米纖維。然后用等離子體對PCL纖維進(jìn)行表面活化，得到PCL纖維表面的羧基，然后將羧基轉(zhuǎn)化為巰基反應(yīng)性馬來酰亞胺(MAL)基團(tuán)，生成MAL功能化的PCL纖維(MAL-PCL)。將功能化的PCL纖維冷凍成長度為40 ~ 80 μm的碎片。然后通過在37 ℃交聯(lián)HA-Ac、MAL-PCL纖維和二巰基聚(乙二醇)(PEGSH) 16小時(shí)來制備NHC(圖1A)。MAL-PCL纖維碎片和HA-Ac偶聯(lián)到PEG-SH交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)上，形成界面共價(jià)鍵，在膠凝過程中形成完整的復(fù)合材料結(jié)構(gòu)(圖1A)。由于NHC的力學(xué)性能和孔徑大小由交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)密度決定，研究者在保持MAL-PCL纖維含量不變的情況下測試了5、10和15 mg/ mL的多個(gè)HA濃度。HA濃度為5、10、15 mg/m L時(shí)，NHC剛度的實(shí)測剪切模量G '分別為100、250、400 Pa(圖1C)。然后，使用之前報(bào)道的方法機(jī)械破碎NHC，將其通過一個(gè)均勻孔徑為0.009英寸的不銹鋼網(wǎng)，產(chǎn)生平均直徑為131.3 ± 18.8 μm的mfNHC。

圖2. ADSC-mfNHC植入物在大鼠皮下注射模型中的宿主細(xì)胞浸潤、巨噬細(xì)胞極化和血管生成

宿主細(xì)胞遷移到mfNHC

研究者在不同的時(shí)間點(diǎn)收集mfNHC構(gòu)建體，以分析宿主細(xì)胞浸潤到構(gòu)建體中的程度(圖2A和B)。值得注意的是，mfNHC中只有微弱的馬松三色染色(圖2B)，表明相對較少的纖維化和瘢痕形成。在第14日和第28日，mfNHC中有早期血管生成的證據(jù)(圖2A-C)。如圖2D所示，在最早的時(shí)間點(diǎn)(第3天)，相對于mfNHC-250(55.4±11%)和mfNHC400(32.1±6.6%)，mfNHC-100中有更多的宿主細(xì)胞浸潤(72.4±7.3%)。這種趨勢持續(xù)至第7天(mfNHC-100: 81.2±6.6%;mfNHC-250: 58.3±7.7%;mfNHC-400: 37.2±4.1%)。然而，在第28天，三組的宿主細(xì)胞浸潤水平相當(dāng)(NHC-100: 89.4±4%;mfNHC250: 73.9±12.7%;mfNHC-400: 69.7±4.1%)。在注射mfNHC后的早期，宿主細(xì)胞浸潤到mfNHC的速度更快，硬度更低;然而，截至第28天，無論mfNHC硬度如何，宿主細(xì)胞浸潤均大致相同。

圖3. CD-PAF大鼠模型的建立及表征

CD-PAF大鼠模型的建立與驗(yàn)證

人類CD-PAF瘺管環(huán)境具有炎癥性且不利于愈合。研究者修改了先前發(fā)表的PAF在大鼠模型中的實(shí)驗(yàn)方案，以接近于模擬這種促炎癥環(huán)境。簡單地說，用2,4,6-三硝基苯磺酸溶液(TNBS)處理6只大鼠誘導(dǎo)結(jié)腸炎(圖3,A、B)。所有大鼠均出現(xiàn)直腸炎/結(jié)腸炎的臨床癥狀，包括糞便柔軟、腹瀉、直腸出血、肛門直腸黏膜腫脹、輕觸黏膜出血等。大鼠在兩次注射TNBS后開始出現(xiàn)癥狀。手術(shù)在3點(diǎn)鐘和9點(diǎn)鐘位置制造瘺管。在肛周皮膚選擇距離肛門約1 cm的瘺管出口點(diǎn)。塞通被放置在新創(chuàng)造的通道中以保持它們的開放。研究者修改了Flacs等人報(bào)道的方案，以增加瘺管的嚴(yán)重程度。具體來說，研究者使用了更厚的掛線(截面為1.2 mm × 2.4 mm)和更大的內(nèi)徑，這意味著更難以治療的模型。此外，為了維持炎癥環(huán)境，在第28天瘺管治療后，我們繼續(xù)向小鼠直腸灌注5%的TNBS，每周2次，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在用TNBS沖洗瘺管的整個(gè)過程中，大鼠持續(xù)出現(xiàn)直腸炎癥的臨床體征(黏膜腫脹、軟便、腹瀉和直腸出血)，這在CD-PAF模型中是理想的。TNBS灌洗瘺管4周后，對所有動(dòng)物進(jìn)行MRI檢查，評估瘺管形成程度。如圖3C中的代表性圖像所示，在第28天對肛周區(qū)域左右兩側(cè)的兩大通暢通道進(jìn)行了成像。此外，瘺管周圍有炎癥的證據(jù)，偶見瘺管周圍有膿腫(圖3D)。在第28天拆除掛線。第42天復(fù)查MRI顯示瘺管仍然通暢，表明瘺管已經(jīng)成熟，沒有自發(fā)愈合的趨勢(圖3E)。第42天處死動(dòng)物，取瘺管組織行組織病理學(xué)檢查。蘇木精-伊紅(he)染色顯示，瘺管部分再上皮化，周圍有明顯的急、慢性炎癥、肉芽組織和輕中度纖維化。也存在斑片狀異物巨細(xì)胞型反應(yīng)，偶見瘺道周圍膿腫。我們還鑒定了腸腔內(nèi)的糞便物質(zhì)(圖3F)。IF染色顯示，扁平的泛細(xì)胞角蛋白(PANCK)陽性腸上皮細(xì)胞可能從瘺管的腸側(cè)遷移，狹窄的鱗狀上皮可能從瘺管的皮膚側(cè)遷移(圖3G)。我們使用IF染色對MPO +中性粒細(xì)胞、CD68 +和CD163+巨噬細(xì)胞、CD20 + B細(xì)胞和CD45RO +記憶T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步表征了瘺管內(nèi)的炎癥環(huán)境(圖3,H至J)。

圖4. ADSC-mfNHC-250治療大鼠CD-PAF的療效

mfNHC-250對大鼠CD-PAF模型的治療效果

在CD-PAF大鼠模型中評估m(xù)fNHC-250的愈合能力。為了減少不同動(dòng)物之間的個(gè)體差異，研究者選擇治療其中一個(gè)瘺管，并將同一動(dòng)物的另一個(gè)瘺管作為手術(shù)對照。對照組和mfNHC治療組瘺口均包括手術(shù)關(guān)閉內(nèi)口。在關(guān)閉內(nèi)口后，mfNHC通過瘺管的皮膚口插入治療的瘺管。因此，mfNHC在治療的瘺管內(nèi)保留良好。mfNHC-250治療后20 d行MRI檢查。行肛周軸位和冠狀位t1加權(quán)MRI掃描。如圖4A所示，T1加權(quán)圖像顯示，與mfNHC-250單獨(dú)治療(無ADSC)相比，ADSC-mfNHC-250治療的瘺口愈合更快，與單獨(dú)手術(shù)相比，ADSC-mfNHC-250治療的瘺口愈合更快。ADSC-mfNHC-250治療組6例瘺管中2例完全愈合，其余4例內(nèi)口和(或)外口閉合，愈合率超過80%。mfNHC-250組瘺管中度愈合，內(nèi)口部分閉合;外孔保持開放;此外，ADSCmfNHC-250組的瘺道較ADSCmfNHC-250組更大。手術(shù)組的瘺口愈合情況最差，瘺道較大，內(nèi)外口均開放。圖中顯示所有軸位和冠狀位MRI掃描圖像。從S7到S15。影片S1和S2顯示了代表性瘺管的三維重建。圖4B包含比較兩個(gè)治療組(ADSCmfNHC-250和mfNHC-250)和外科治療組瘺口長度、寬度和體積的點(diǎn)圖。手術(shù)組、mfNHC-250組、ADSC-mfNHC-250組的瘺管體積分別為(39.18±15.8)、(18.67±11.16)、(6.57±9.5)mm3。

圖5. RT-PCR陣列與治療瘺管的RNA

ADSC-mfNHC-250處理對基因表達(dá)的影響

為了探索ADSC-mfNHC-250促進(jìn)瘺管愈合的機(jī)制，研究者對從PAF組織中提取的RNA進(jìn)行了實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)陣列。我們使用了含有CD-PAF相關(guān)基因的逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)芯片試劑盒。如圖5A所示，ADSC-mfNHC-250處理抑制了與炎癥和免疫相關(guān)的基因:Ccl11、Ccr2、Ccr5、Ccr9、干擾素-γ (IFN-γ)、白細(xì)胞介素-13 (IL-13)、IL-5、IL-6，以及與細(xì)胞外基質(zhì)和纖維化相關(guān)的基因:Cx3cr1、Cxcl12、Cxcr3、ITGB2、Mmp1、Mmp10、Mmp12、Mmp3、Mmp7。Real-time RT-PCR對RT-PCR芯片中所選基因驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)。具體而言，與手術(shù)治療相比，ADSC-mfNHC-250抑制TNF-α(2.85倍)、IL-6(16.7倍)、IL-1α(3.2倍)、IFN-γ(2.7倍)、IL-1β(2倍)、IL23α(6.7倍)、Ccr1(3.1倍)、Ccr5(3倍)和Ccl1(4倍)(圖5B)。mfNHC-250單獨(dú)抑制這9個(gè)基因中的4個(gè):IL-6(6.7倍)，IL-1β(2.5倍)，IL-33(3倍)和Ccl11(2.1倍)。這些結(jié)果表明，ADSC-mfNHC-250抑制PAF的促炎和促纖維化環(huán)境，從而誘導(dǎo)組織修復(fù)。

圖6. 瘺管IF染色

ADSC-mfNHC-250處理對免疫細(xì)胞浸潤的影響

為了研究治療對局部免疫細(xì)胞的影響，研究者對所有治療組的瘺管組織進(jìn)行了IF染色。如圖6 (A ~ C)所示，ADSC-mfNHC-250處理的瘺管與外科手術(shù)和mfNHC-250處理的瘺管相比，MPO+中性粒細(xì)胞、CD20+ B淋巴細(xì)胞、CD45RO+記憶性T淋巴細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞相對較少。為了進(jìn)一步探索局部免疫細(xì)胞在三個(gè)治療組中的分布，在每個(gè)治療組結(jié)束時(shí)收集瘺管組織，分離成單細(xì)胞懸液，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。如圖7 (A和B)所示，較少的CD11b+抑制了關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子如IFN-γ、CCL3、IL6、TNF-α、CCL20和IL-17，增加了抗炎細(xì)胞因子如IL-4和IL-13。為進(jìn)一步證實(shí)CD-PAF相關(guān)細(xì)胞因子的變化，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-10。圖7E的結(jié)果顯示，與手術(shù)治療的瘺管相比，ADSC-mfNHC-250抑制TNF-α(2倍)和IL-6(1.5倍)。mfNHC250治療組與手術(shù)治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ADSC-mfNHC-250可調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，具有加速瘺口愈合的凈效應(yīng)。

圖7. 流式細(xì)胞術(shù)分析ADSC-mfNHC-250處理CD-PAF的免疫細(xì)胞分布及細(xì)胞因子譜分析

小結(jié)：研究者認(rèn)為，針對管腔炎癥的全身治療(如生物制劑或小分子藥物)需要與CD-PAF的局部治療相結(jié)合，以最大限度地影響瘺管。理想的局部瘺治療方法應(yīng)直接應(yīng)用于瘺道，以解決局部炎癥，以及允許糞便、膿液和血液引流的生理缺陷。我們設(shè)計(jì)并測試了這種組織修復(fù)支架，以滿足多種條件: (i)易于應(yīng)用于瘺管，(ii)高孔隙率以允許再生宿主細(xì)胞遷移到支架中，(iii)高機(jī)械剛度以保持其在瘺管中的形狀和完整性，(iv)免疫調(diào)節(jié)特性和增強(qiáng)的血管生成反應(yīng)和血管生長到支架中，以及(v)共遞送ADSCs并將其保留在復(fù)合材料中以最大限度地發(fā)揮ADSC在瘺管中的作用。為了滿足這些設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，研究者創(chuàng)造了一種透明質(zhì)酸(HA)水凝膠與電紡聚己內(nèi)酯(PCL)納米纖維碎片共價(jià)連接，形成完整的納米纖維-水凝膠復(fù)合材料(NHC)。該NHC是機(jī)械破碎的(mfNHC)，并負(fù)載ADSCs，然后在臨床相關(guān)的CD-PAF大鼠模型中進(jìn)行測試。

來源：高分子科學(xué)前沿