??2019年5月8日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、合成與功能生物分子中心陳鵬課題組與王初課題組在《自然》雜志在線發(fā)表題為“Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems”的研究論文，報(bào)道了兩個(gè)課題組合作發(fā)展的一種在活體環(huán)境下瞬時(shí)激活蛋白質(zhì)的化學(xué)生物學(xué)新技術(shù)。

在活細(xì)胞等生理環(huán)境下開(kāi)展蛋白質(zhì)功能的原位研究具有重要的科學(xué)意義。陳鵬課題組長(zhǎng)期致力于發(fā)展蛋白質(zhì)的原位激活技術(shù)，希望為活細(xì)胞內(nèi)的每一個(gè)蛋白質(zhì)安裝“調(diào)控開(kāi)關(guān)”。最近，他們與王初課題組展開(kāi)合作，提出并發(fā)展了一種蛋白質(zhì)“鄰近脫籠”策略，將可遺傳編碼的非天然氨基酸脫籠技術(shù)與計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)篩選技術(shù)相結(jié)合，在一系列不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)上實(shí)現(xiàn)了高時(shí)間分辨的原位激活，為在活細(xì)胞及活體動(dòng)物內(nèi)研究蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制提供了一種普適性技術(shù)。利用這一被命名為CAGE-prox的新方法，他們建立并驗(yàn)證了“激酶正交激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控”“時(shí)間分辨的蛋白質(zhì)組學(xué)分析”“基于毒素蛋白的抗腫瘤蛋白前藥”等一系列原創(chuàng)應(yīng)用，展示了這一化學(xué)生物學(xué)新技術(shù)在開(kāi)展蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)功能研究與調(diào)控中的優(yōu)勢(shì)和特色。

“鄰近脫籠”策略

陳鵬課題組先前提出的“化學(xué)脫籠”策略，可通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)關(guān)鍵殘基的化學(xué)保護(hù)和脫保護(hù)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)其活性的“關(guān)－開(kāi)”調(diào)控（Nat. Chem. Biol.2016, 12, 129）。利用這一技術(shù)，他們先后在賴(lài)氨酸（Nat. Chem., 2014, 6, 352; Nat. Chem. Biol., 2014, 10, 1003）、酪氨酸（J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 15118）等天然氨基酸側(cè)鏈上實(shí)現(xiàn)了生物正交斷鍵反應(yīng)和化學(xué)脫籠，開(kāi)展了激酶等蛋白質(zhì)家族的特異激活和機(jī)制研究（ACS Cent. Sci, 2016, 2, 325，ACS Cent. Sci. 2019, 5, 145）。由于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的種類(lèi)繁多、活性調(diào)控機(jī)制各異，目前該方法仍受可供脫籠的氨基酸種類(lèi)限制，無(wú)法適用于所有蛋白質(zhì)。

為了解決這一瓶頸問(wèn)題，陳鵬課題組與王初課題組合作提出了“鄰近脫籠”的新策略。該策略通過(guò)向蛋白質(zhì)活性中心附近引入一種帶有光保護(hù)基團(tuán)的非天然酪氨酸（ONBY）, 可同樣實(shí)現(xiàn)對(duì)其活性的遠(yuǎn)程干擾和抑制；隨后通過(guò)“光脫籠”反應(yīng)將保護(hù)基團(tuán)移除，使其活性重新恢復(fù)。由于在蛋白質(zhì)活性口袋附近插入ONBY后能夠通過(guò)影響蛋白穩(wěn)定性、底物結(jié)合等多種因素調(diào)控蛋白質(zhì)活性，該策略將原有的“活性位點(diǎn)脫籠”轉(zhuǎn)變?yōu)椤盎钚钥诖摶\”，極大地?cái)U(kuò)展了該方法的適用范圍。

基于“鄰近脫籠”策略的假設(shè)，需要保證在該“特定位點(diǎn)”插入ONBY時(shí)，可以通過(guò)阻斷底物結(jié)合從而有效抑制蛋白質(zhì)的活性，而在經(jīng)過(guò)光脫除反應(yīng)后，在這個(gè)位點(diǎn)引入的酪氨酸突變不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的活性產(chǎn)生影響。在實(shí)際操作過(guò)程中，面臨的重要問(wèn)題是如何在目標(biāo)蛋白中快速而又準(zhǔn)確地找到插入ONBY的“鄰近位點(diǎn)”，從而避免對(duì)目標(biāo)蛋白所有位點(diǎn)進(jìn)行突變篩選的繁瑣實(shí)驗(yàn)流程。王初課題組擅長(zhǎng)利用計(jì)算機(jī)輔助的化學(xué)生物學(xué)方法在蛋白質(zhì)組中發(fā)現(xiàn)和鑒定活性功能位點(diǎn)（Biochemistry,2018,57,451; ACS Cent. Sci.,2018,4, 960）。在這一合作工作中，他們借助計(jì)算機(jī)輔助的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，對(duì)目標(biāo)蛋白中可以插入ONBY的合適鄰近位點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)地虛擬篩選，通過(guò)計(jì)算其所處位置的幾何參數(shù)以及對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響的能量參數(shù)選出合適推薦的位點(diǎn)供實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這一步驟避免了繁瑣的人為操作，極大地提高了CAGE-prox方法的成功率和普適性。

CAGE-prox的應(yīng)用

在建立CAGE-prox的標(biāo)準(zhǔn)操作流程后，兩個(gè)課題組合作分別在熒光素酶、GTP水解酶、RNA去甲基化酶FTO、蛋白激酶、caspase細(xì)胞凋亡蛋白酶和炭疽致死因子（lethal factor）金屬蛋白酶等一系列不同類(lèi)型的蛋白上展示了該瞬時(shí)激活方法在活體環(huán)境下的普適性。在此基礎(chǔ)上，他們進(jìn)一步利用CAGE-prox建立了活細(xì)胞內(nèi)的激酶正交激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，完成了細(xì)胞凋亡蛋白酶的瞬時(shí)激活和酶切底物的組學(xué)鑒定，并通過(guò)激活細(xì)菌毒素蛋白（炭疽致死因子）開(kāi)發(fā)了抗腫瘤蛋白質(zhì)前藥的治療策略。這一通用的蛋白質(zhì)原位激活技術(shù)有望在未來(lái)應(yīng)用到動(dòng)態(tài)生命過(guò)程的基礎(chǔ)研究和疾病治療的轉(zhuǎn)化研究當(dāng)中。

北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院博士畢業(yè)生王杰，化學(xué)與分子工程學(xué)院博士后劉源、研究生劉衍軍為該論文共同第一作者，陳鵬教授和王初研究員為本文的共同通訊作者。該項(xiàng)工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委、科技部、教育部、北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心和北大—清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。王初研究員特別感謝中組部“青年千人計(jì)劃”的支持。

該論文在線發(fā)表后，得到了國(guó)內(nèi)和國(guó)外同行的廣泛關(guān)注。本領(lǐng)域國(guó)際著名專(zhuān)家美國(guó)北卡羅來(lái)納大學(xué)的Klaus Hahn教授在《自然》雜志同期為本文撰寫(xiě)了亮點(diǎn)推薦介紹（原文鏈接：https://www.nature.com/articles/d41586-019-01394-1）。我國(guó)化學(xué)與生命科學(xué)交叉領(lǐng)域的多位專(zhuān)家也對(duì)該工作給予了專(zhuān)業(yè)點(diǎn)評(píng)（原文鏈接：https://mp.weixin.qq.com/s/IehHGMuHVzdilAWkjrTlSg）。